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活細(xì)胞成像中環(huán)境的控制

更新時(shí)間:2021-07-16      點(diǎn)擊次數(shù):1973

Microscope Live Cell Imaging


什么是活細(xì)胞成像

活細(xì)胞成像(live cell imaging)是捕捉活的、活動(dòng)狀態(tài)的細(xì)胞圖像的技術(shù),通過(guò)顯微觀察研究活細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。通過(guò)活細(xì)胞成像技術(shù)可以實(shí)時(shí)顯示和定量細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。并且可以研究活體系統(tǒng)中的細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能和組織,有助于開(kāi)發(fā)在生物學(xué)上更加相關(guān)且能更好預(yù)測(cè)人體對(duì)新候選藥物反應(yīng)的測(cè)定方法。

活細(xì)胞成像的典型應(yīng)用用于研究動(dòng)力學(xué)事件,包括酶活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)運(yùn)輸和膜循環(huán)過(guò)程等。



活體細(xì)胞成像可以用培養(yǎng)細(xì)胞系(如HEK細(xì)胞,HeLa細(xì)胞)、原代細(xì)胞培養(yǎng)(如皮膚細(xì)胞)或切片進(jìn)行。在顯微鏡下,正常的細(xì)胞功能對(duì)于研究活躍的生物過(guò)程是非常重要的,但許多細(xì)胞無(wú)法適應(yīng)偏離最佳生長(zhǎng)的環(huán)境,包括pH值、緩沖能力、溫度、O2濃度和滲透壓。


pH值


pH值是細(xì)胞系高效生長(zhǎng)的關(guān)鍵。

例如,大多數(shù)細(xì)胞系在pH 7.2-7.4時(shí)繁殖最好,成纖維細(xì)胞在pH 7.7時(shí)繁殖旺盛,轉(zhuǎn)化細(xì)胞系在pH 7左右時(shí)表現(xiàn)優(yōu)異。為了跟蹤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基pH值的變化,在某些情況下使用苯酚紅作為pH值的指示劑,pH值為7.4時(shí)為紅色。苯酚紅在酸性溶液中變?yōu)槌壬?pH 7)和黃色(pH 6.5),在堿性溶液中變?yōu)榉凵?pH 7.6)和紫色(pH 7.8)。然而,在活細(xì)胞成像中常用的培養(yǎng)基配方避免使用酚紅,因?yàn)槠涔馕障庀禂?shù)高,可能造成背景噪音。




緩沖液


pH緩沖系統(tǒng)通常包含碳酸氫鈉和外部供應(yīng)CO2。此外,合成的生物緩沖液,如HEPES,可用于短期研究時(shí)緩沖培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞外溶液不能用HEPES緩沖時(shí),CO2被輸送到系統(tǒng),當(dāng)與細(xì)胞外溶液接觸時(shí)分解為碳酸氫鹽。這就是為什么顯微鏡下的活細(xì)胞成像通常需要專門可調(diào)節(jié)大氣而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)室。一般情況下,10-20mM HEPES緩沖液的濃度可以在無(wú)CO2存在時(shí)控制pH值,為碳酸氫鈉提供最佳的生長(zhǎng)條件。




CO2濃度


細(xì)胞系對(duì)氧氣的需求量變化很大。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體內(nèi)呼吸通常需要氧氣,但在體外培養(yǎng)成種子細(xì)胞系或永生化后,通??梢蕴娲鷧捬跆墙徒狻5蠖鄶?shù)活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)并不需要嚴(yán)格的O2調(diào)控。有趣的是,氧氣的消耗經(jīng)常被用作一種策略,以減少通過(guò)與活性氧的反應(yīng)而發(fā)生的光損傷。這一策略可能涉及氧氣消耗系統(tǒng),如氧化酶或抗氧化劑,如維生素C,以限制自由基的損害。然而,在某些情況下,O2張力降低可能導(dǎo)致缺氧應(yīng)激,這對(duì)細(xì)胞是有危險(xiǎn)的。




滲透壓


大多數(shù)細(xì)胞系在260 ~ 320 mosM的滲透壓值范圍內(nèi)高效生長(zhǎng)。當(dāng)添加HEPES來(lái)改變培養(yǎng)基組分時(shí),監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基的滲透壓是很重要的。大多數(shù)成像室容納小體積,在培養(yǎng)基溫度較高時(shí),由于蒸發(fā)作用,滲透壓會(huì)發(fā)生變化。在大多數(shù)情況下,顯微鏡有一個(gè)二氧化碳控制的孵育室,用于在37攝氏度下處理哺乳動(dòng)物細(xì)胞。低滲培養(yǎng)基可以在培養(yǎng)皿中常規(guī)替代,以補(bǔ)償蒸發(fā)。也可以通過(guò)將培養(yǎng)基密封在一個(gè)開(kāi)放的機(jī)油室或通過(guò)控制濕度來(lái)最小化蒸發(fā)。




哺乳動(dòng)物細(xì)胞活體成像環(huán)境控制



在短期研究中應(yīng)用大體積培養(yǎng)基可以避免由于蒸發(fā)而造成的滲透壓和O2的偏差。長(zhǎng)期研究可采用加熱機(jī)組、加濕器孵育室、碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)相結(jié)合的方式對(duì)環(huán)境參數(shù)進(jìn)行控制。

為了更好地解釋活體細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,通常采用先進(jìn)的寬視野和共聚焦顯微鏡技術(shù)。例如,細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育是在相位對(duì)比和差分干涉對(duì)比(DIC)顯微鏡下觀察的,但發(fā)育胚胎研究有時(shí)更傾向于在立體顯微鏡下觀察。另一方面,熒光技術(shù)被用來(lái)標(biāo)記特定的細(xì)胞化合物,使它們?cè)诠簿劢癸@微鏡下更容易觀察到。然而,活細(xì)胞成像系統(tǒng)被限制在一定的最佳條件下,以確保細(xì)胞保持在健康的狀態(tài)。


綜上所述,活體細(xì)胞成像既需要在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中關(guān)注細(xì)胞的功能,也需要應(yīng)用特定的實(shí)驗(yàn)方法。因此,評(píng)估培養(yǎng)基、環(huán)境控制、pH值和成像技術(shù)在這類實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用是很重要的。




圖片




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MC102

塔望科技開(kāi)發(fā)的MC102活細(xì)胞成像環(huán)境控制器,可配合常規(guī)顯微鏡,很好的實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞成像,可實(shí)現(xiàn)在顯微鏡下長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)細(xì)胞成像。

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精確控制培養(yǎng)小室內(nèi)的環(huán)境:溫度、濕度、氧氣濃度、二氧化碳濃度


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